|
|
冯东 黄加栋 朱思荣 刘仲汇 冯德荣
(山东省科学院生物研究所 济南 250014, 电话0531-2605395)
|
|
在分离纯化谷氨酸氧化酶过程中同时得到的谷氨酰胺水解酶。该酶与谷氨酸氧化酶的混合酶是制作谷氨酰胺酶膜的好材料，制得的谷氨酰胺酶膜，可在具有差分分析功能的SBA-40C型生物传感分析仪上实现了谷氨酰胺的分析。
该谷氨酸-谷氨酰胺双功能分析仪，有两个H2O2电极，一个电极装有复合酶膜，膜上固定着谷氨 酰胺酶和谷氨酸氧化酶，另一个电极上固定着谷氨酸氧化酶，两个酶膜反应最终产物H2O2由H2O2电极检测，经差分程序处理，测定谷氨酰胺结果可自动把样品中本底谷氨酸值减去，从屏幕上直接显示测得谷氨酰胺含量及本底谷氨酸含量并自动打印结果。此方法快速准确，有利于自动化分析，可广泛用于食品成分监测、质量检验及发酵在线控制及动物细胞培养。
1. 测定原理：
|
|
|
谷氨酰胺酶
|
| L-谷氨酰胺 + H2O ------→ L-谷氨酸 + NH3 (1) |
| |
| 谷氨酸氧化酶 |
|
L-谷氨酸 + O2 + H2O ------→ α-酮戊二酸 + NH3 + H2O2 (2)
其中左电极为反应原理(2)，右电极为反应原理(1) (2)。
|
|
| 2. 谷氨酰胺测定系统的结构：谷氨酰胺测定系统由反应系统、两支过氧化氢电极和微机信号处理系统组成。结构示意图如图1，左电极为谷氨酸酶电极，右电极为谷氨酰胺酶电极。 |
|
 |
|
图1 反应系统结构示意图
1、有机玻璃块 2、酶膜 3、反应池 4、进样针通道 5、反应池顶帽 6、进样帽 7、进样传感器 8、电极 9、电极固定螺帽
10、缓冲液排出管 11、缓冲液进入管 12、搅拌子
|
|
|
3. 测定方法
3.1 定标：开机后，用100mg/100ml 谷氨酸标准液，进样量25ml，注入反应池后，20秒钟后显示打印数据，按动"定标"钮定标100，对谷氨酸定标完成；按动"功能"?"3"?"100"?"输入"，再用10mM谷氨酰胺标准液进样量25ml，注入反应池后20秒显示打印结果，按动
"1"键，则对谷氨酰胺定标完成。
|
|
3.2 样品测定：定标后，注入25ml待测样品于反应池中，20秒后显示打印结果，左屏幕显示谷氨酸含量（mg/100ml
），右屏幕显示谷氨酰胺含量（mM）。
4. 仪器的稳定性和线性
对谷氨酸标准液（100mg/100ml ）和谷氨酰胺标准液（10mM）连续测定20次，将数据进行统计处理，结果表明仪器测定谷氨酰胺具有良好的稳定性
(资料略) 。
用不同浓度谷氨酰胺标准液来测定其线性，结果见表1。
表1、 谷氨酰胺酶膜的线性试验
|
| 谷氨酰胺 |
浓度(mM ) |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
12 |
14 |
16 |
18 |
20 |
| 响应值 |
5 |
26 |
49 |
72 |
100 |
127 |
157 |
169 |
193 |
212 |
|
表1结果表明，谷氨酰胺酶膜在8mM-20mM浓度范围内，电极测定线性较好。该分析仪还设置有线性校正功能，可以对电极进行线性校正。
谷氨酰胺是动物细胞培养中很特殊的必需氨基酸，它既可作为细胞生长的主要能源，又可以作为氮源[1]。清华大学化学工程系用我们研制的谷氨酰胺分析仪，考察了储存和培养条件下谷氨酰胺的化学降解，及批次培养条件下谷氨酰胺消耗与杂交瘤细胞生长之间的关系，得到了满意的数据和结果，该研究已形成文章发表[2]。
参 考 文 献
[1]许平，孙际宾等，谷氨酰胺的研究及开发进展，第二届全国发酵工程学术讨论会论文集，1998，235~236.
[2]辛艳，杨艳等, 谷氨酰胺在杂交瘤细胞培养中的降解与代谢，生物工程学报，2001，17（4）：478~480.
|
|
|
|
| |
|
|
| |
|
|
