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朱思荣 毕春元 周万里 刘仲汇 冯德荣
(山东省科学院生物研究所,济南 250014)
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测定发酵过程中微生物菌体的数量和菌体的生长情况，对发酵过程的控制和发酵产品的品质控制具有十分重要的意义，本项研究探讨了利用葡萄糖生物传感器，测定发酵过程中微生物活细胞的方法及测定条件。
一、 测定原理：
微生物细胞在其生长或生活过程中，总是优先利用葡萄糖作为基本能源和碳源，在细胞没有营养限制因素的条件下，微生物对葡萄糖的利用数量与微生物细胞的数量和细胞所处的生长时期有关，微生物发酵过程中，一定的发酵时期微生物细胞处于一定的生长期，所以可以通过测定细胞对葡萄糖的利用量来估测细胞的数量。
固定化酶葡萄糖生物传感器测定灵敏度高，测定速度快，能够满足细胞测定的要求。
二 测定装置：
待测样品和葡萄糖加入到恒温培养池内开始计时，到设定的第一次采样时间后，开动蠕动泵采样约0.5ml，到菌体灭活池，采样时蠕动泵正反方向运行相同时间，采样结束后管道内不存液体。再过20分钟，再次取样0.5ml，定时采样控制由微型计算机系统自动完成。采样后手工完成采集样品的葡萄糖含量测定。葡萄糖含量与细胞数的转换也由微型计算机系统完成，不同细胞的生长时期，葡萄糖的利用与菌体数的关系，通过切换转换模式实现。
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三、 测定结果
1．不同浓度的微生物细胞对葡萄糖的利用情况
以下是我们对摇瓶培养23小时的酿酒酵母发酵液多级稀释后，20分钟时间实际消耗葡萄糖的测定结果，表中细胞浓度通过平板培养计数法测定。
表一：不同稀释比例酿酒酵母发酵液20分钟耗糖值
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| 细胞稀释 |
1 |
3/4 |
1/2 |
1/4 |
1/8 |
1/16 |
1/32 |
| 细胞浓度 |
1.31×108 |
9.83×107 |
6.66×107 |
3.28×107 |
1.64×107 |
8.19×106 |
4.09×106 |
| 测定1 |
97 |
71.5 |
52.9 |
36.3 |
29.7 |
17.9 |
12.5 |
| 测定2 |
101.5 |
72 |
53.3 |
39.7 |
28.9 |
18.8 |
13.8 |
| 平均值 |
99.25 |
71.75 |
53.1 |
38.0 |
29.3 |
18.35 |
13.15 |
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实验结果显示，当细胞浓度低于2×107时菌体对葡萄糖的利用速度较快，当菌体浓度高于2×107后，葡萄糖的消耗与菌体浓度有较好的线性关系，在作计数测定时，必须对此非线性提供补偿。
2． 样品的重复测定试验：
实验结果是否能重复是测定方法是否可行的根本依据，为了验证葡萄糖消耗法测试细胞数这一方法，我们分别对二次摇瓶培养的酿酒酵母作了重复计数测定，实验结果显示：对于同一样品，仪器测定有较好的重复性，测定误差小于10%。
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| 表二：酿酒酵母发酵原液6次测定实验结果 |
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
平均 |
| 葡萄糖消耗值 |
99.7 |
88.0 |
92.8 |
100.8 |
100.7 |
101.1 |
97.18 |
| 细胞计数（×106） |
131.6 |
116.2 |
122.5 |
133.0 |
132.9 |
133.4 |
128.3 |
| 计数结果统计 |
n=6, s=7.21, cv=5.62% |
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| 表三：酿酒酵母用磷酸缓冲液稀释5倍后，测定6次实验结果 |
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1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
平均 |
| 葡萄糖消耗值 |
28.3 |
28.8 |
30.4 |
29.6 |
29.1 |
30.7 |
29.48 |
| 细胞计数（×106） |
15.6 |
16.0 |
18.4 |
16.9 |
16.4 |
19.0 |
17.05 |
| 细胞计数统计 |
n=6, s=1.362, cv=7.99% |
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3． 测量范围
实际测定的数据显示，本仪器测定的微生物细胞数的分辨率为106数量级，当微生物细胞数小于这个数量级时，葡萄糖生物传感器的测定精度和细胞对葡萄糖消耗的非线性使测定结果误差太大，失去参考价值。
四、 小结
利用微生物活细胞对葡萄糖的消耗数量，推测微生物活细胞的数量，原理明确、操作简便，测定可靠性高，但需要对不同的细胞生长期建立葡萄糖消耗与细胞数量的相关模型，保证测定结果的准确性。对于工业微生物发酵生产，因为发酵的条件基本一致，所以模型建立相对容易，本方法具有实用价值，当发酵异常时，测得的细胞数可能不准，但异常的数据能对发酵控制提供及时的警告信息。
参 考 文 献
1. 郝冬霞等. 细胞生长测定方法与研究进展. 微生物学通报, 2001年28（6）, p82
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